суббота, 8 ноября 2014 г.

Пептидо-нуклеиновые кислоты - особенности и возможности

Пептидо-нуклеиновые кислоты, ПНК – синтетические соединения, по структуре подобные олигонуклеотидам. В их основе - скелет, подобный скелету ДНК, где остатки фосфо-рибозы замещены N- (2-амино-этил) глициновыми остатками, связанными этилен-диаминовыми связями. Азотистые основания соединены с глицином метиленовыми мостиками, а расстояние между ними соответствует расстоянию, характерному для ДНК. Благодаря этому ПНК связывает ДНК и РНК с участием водородных связей, однако полученные дуплексы устойчивы к ионам и температуре. Молекулы ПНК незаряжены, они гидрофобны, а, значит, нерастворимы, что ограничивает их возможность проникать в клетку и применение в биотехнологии. Однако их преимуществом является невосприимчивость к ферментативному гидролизу.

ПНК-зонды связываются с мишенями с очень высокой специфичностью. Это объясняется тем, что они более чувствительны к несовпадению оснований при формировании дуплекса с ДНК, чем аналогичная последовательность ДНК. Дуплексы ПНК-ДНК более устойчивы к нагреванию, чем ДНК-ДНК дуплексы, но ещё более устойчивы к температуре связи в дуплексе ПНК-РНК, при условии полной комплементарности. При наличии несвязанных пар стабильность дуплексов резко падает. В отличие от взаимодействий природных нуклеиновых кислот, дуплексы, образуемые ПНК с ДНК и РНК, могут быть не только антипараллельными, но и параллельными, причём вторые более термостабильны.
ПНК могут формировать не только дуплексы, но и триплексы с ДНК, блокируя при этом транскрипцию. Таким свойством обладают гомопиримидиновые ПНК, при этом две цепи ПНК вытесняют гомопиримидиновую цепь ДНК из дуплекса со второй цепью и связываются с оставшейся. Наиболее эффективно ПНК связываются с активно транскрибируемой ДНК благодаря её конформации. Если образование дуплекса может блокировать инициацию транскрипции, то только сборка триплексной структуры на цепи ДНК может блокировать элонгацию РНК.
ПНК-РНК дуплексы устойчивы к РНКазе, но они блокируют созревание, транспорт и трансляцию РНК (при связывании на первом кодоне). ПНК также могут ингибировать обратную транскрипцию в клетках, заражённых вирусами, путём связывания с вирусными РНК. Такие блокирующие синтетические структуры в перспективе могут войти в состав лекарственных препаратов. Связываясь с РНК в составе теломеразы, соответствующие ПНК могут ингибировать её активность.
Особенности ПНК, такие как специфичность связывания и устойчивость, позволяют рассматривать их в качестве замены или дополнения ДНК-олигонуклеотидам в различных молекулярно-биологических методиках. C помощью ПНК-зондов можно предотвратить накопление в ПЦР неспецифического продукта в тех случаях, когда точность реакции жизненно важна, например, при поиске соматических мутаций в злокачественной опухоли. Если мутация выявляется с помощью специфических праймеров, сайты их связывания дикого типа, не содержащие искомой замены, но способные связать праймер, что приведёт к ошибочному накоплению продукта, можно надёжно связать устойчивой и высокоспецифичной связью с ПНК. ПНК можно использовать и для «расправления» цепей при амплификации. Когда необходимо амплифицировать участки повторов, присутствующих в геноме в виде двух, различных по длине аллелей, случается, что короткая аллель представлена в конечном продукте в большей концентрации, чем длинная. Однако если использовать ПНК, более длинные фрагменты не будут формировать вторичных структур, препятствующих амплификации и ампликоны обоих аллелей будут накапливаться пропорционально. Так как в данном случае уже работающая полимераза встречает ПНК-зонд на цепи, он просто отсоединяется, не препятствуя процессу репликации. ПНК может распознаваться как праймер, более специфичный, чем традиционно используемые олигонуклеотиды. Химерные праймеры, содержащие ДНК на конце, распознаваемом полимеразой и являющиеся ПНК в остальной части последовательности распознаются и достраиваться полимеразами в ходе ПЦР.
Используются ПНК и в качестве зондов для гибридизации в составе разнообразных сенсоров. Были, например, предложены сенсоры на основе кварцевых резонаторов, где целевые ДНК мишени выявлялись при помощи ПНК-зондов. Нанесённые на поверхность золотого носителя в составе сенсоров, работающих с применением детекции поверхностного плазмонного резонанса, ПНК можно регенерировать после гибридизации и использовать биосенсор повторно.
Устойчивость ПНК к ферментам и нетоксичность делают их привлекательными для использования в исследовательских целях для ингибирования экспрессии генов в клетках. Ни с чем не связанная, свободная ПНК проходит в клетку только при очень больших концентрациях, поэтому ПНК вводят в клетки путём трансфекции, трансдукции вирусами, электропорации, с помощью ультразвука, а также в составе липосом. Ведётся и поиск способов сделать подобные соединения, которые лучше, чем существующие ПНК, проходят через мембраны клеток. Как уже было сказано, ПНК незаряжена, однако, если это необходимо, в ПНК можно встроить остатки с отрицательным или положительным зарядом. Встраивание положительно заряженных лизиновых остатков повышает растворимость олигомера. Также обсуждалась возможность воздействовать на мембраны клеток-реципиентов, и конъюгировать ПНК с пептидами, благодаря которым ПНК быстро проходит например, в нейроны коры мозга.

ПНК могут применяться в разработке лекарств, биотехнологии, диагностике с использованием биосенсоров, они нетоксичны, поэтому их иногда также рассматривают как действующее вещество лекарственных препаратов. Эти соединения можно получить только химическим путём, и ряд исследований посвящён возможностям их модификаций – от изменения структуры скелета до конъюгации с различными молекулами, чтобы сделать их применение более широким.

Комментариев нет:

Отправить комментарий