воскресенье, 7 сентября 2014 г.

Геном единичной клетки - новый уровень в понимании биологии микроорганизмов

Метагеномика позволила описать общий геном сообществ, и, путём анализа этих данных обнаружить присутствие ранее неописанных микроорганизмов и выяснить, какие процессы протекают в той или иной биологической системе. Количество некультивируемых, криптических микроорганизмов оказалось огромным. Это означает, что выделить их в культуру и узнать их свойства невозможно. Развитие технологий, однако, уже позволяет исследовать геном единичных клеток. Такая возможность – огромный шаг вперёд в понимании функционирования биологических систем. Теперь в сложном метагеноме, например, метагеноме кишечника человека или морской воды можно привязать те или иные гены, а значит, и функции, к определённым видам микроорганизмов. Конечно, это развивающиеся методики, использованные, пока, в отдельных исследованиях, тем не менее, первые их результаты уже опубликованы.

Как правило, при исследовании сложного бактериального сообщества, микроорганизмы концентрируют для дальнейшего исследования и отделяют от других возможных примесей. После этого, тем или иным способом, из этой смеси можно выделить интересующий микроорганизм. Затем из него выделяется ДНК, проводится её накопление и анализ. Специфика задачи требует специализированных средств обработки данных. К лабораториям, осуществляющим подобные исследования, предъявляются очень высокие требования с точки зрения защиты от контаминации, поскольку материал отбирается из единичных клеток, и попадание в образец чужеродной ДНК даже в очень низких концентрациях может губительно сказаться на результате. Понятно, что с учётом всех сложностей, полноценного генома единичной клетки получить пока не удалось, однако существующие методики позволяют исследовать уже порядка 70% ДНК, присутствующей в клетке.
Выделение клетки из препарата можно осуществить микроманипулятором под микроскопом. Это может быть удобным способом, если сообщество не отличается разнообразием, а форма изучаемого микроорганизма является характерной и узнаваемой. Например у насекомых Draeculacephala minerva найдено два вида внутриклеточных некультивируемых симбионтов - “Candidatus S. muelleri” и “Candidatus Baumannia cicadellinicola”, содержащиеся в специализированных органеллах насекомого. Они помогают клеткам получать ряд веществ, которые отсутствуют в рационе хозяина. Применение микроскопов и микроманипуляторов позволило отделить единичные клетки симбионта S. muelleri , отличающиеся по форме от другого симбионта. Хотя, конечно, материал оказался контаминирован, избежать неправильной интерпретации удалось, используя для сборки генома уже полученный ранее геном данного вида.
Использования активированного флюоресценцией сортинга клеток достаточно надёжно защищает от попадания в пробу чужеродной ДНК, как это может произойти при использовании микроманипулятора. Для осуществления разделения данным способом используются флюоресцентные зонды, например гибридизующиеся только с ДНК в клетках бактерий изучаемого вида.Например. до 35% массы губки могут составлять симбионты. Это, по крайней мере, 30 фил бактерий и археи. Доминирующей филой является кандидатная фила Poribacteria. Единичные клетки бактерий этой филы были отделены путём флюоресцентно-активированного сортинга. Так удалось найти гены, продукты которых участвуют в процессе гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорелирования. В геноме были найдены также гены, продукты которых позволяют бактериям синтезировать все необходимые для жизни вещества, то есть, вряд ли они являются ауксотрофами, к тому же, вероятно, они могут фиксировать азот. Симбионт может потреблять в качестве источников питательных веществ и энергии разнообразные молекулы благодаря широкому набору ферментов. Белки, содержащие домены, по структуре сходные с белками эукариот, например, с анкиринами могут участвовать во взаимодействии с хозяином, в частности, защищая симбионта от фагоцитоза.
Разнообразные технологии, основанные на микрофлюидике, позволяют, как и клеточный сортинг, отобрать клетки с минимальной контаминацией чужеродной ДНК. С другой стороны, они не требуют дополнительных флуоресцентных меток. Сегментированные нитчатые бактерии, входящие в род  Clostridia являются видоспецифичными симбионтами кишечника многих позвоночных, где они связываются с поверхностью эпителия. Особый интерес они представляют, поскольку отмечено их влияние на работу иммунной системы. Несколько таких нитей удалось отобрать с помощью микрофлюидного устройства. Исследование генов белков наружной мембраны показало, что у микроорганизмов, выделенных из кишечника различных хозяев, они могут значительно различаться, что, возможно, связано с процессом адаптации к хозяину. Микроорганизмы разрушают пептиды, поглощают аминокислоты и другие молекулы, самостоятельно синтезировать многие аминокислоты и витамины они не способны. Найдены гены, продукты которых участвуют во взаимодействии с иммунной системой, а также в выведении токсичных молекул и антимикробных соединений из клетки. Были найдены ферменты, защищающие от мочевой кислоты и лизоцимов, система защиты от окислительного стресса и, возможно, система, формирующая защитную полисахаридную капсулу вокруг клетки.
Для исследования генома вида, который невозможно культивировать, используют данные секвенирования множества единичных клеток, но надо помнить, что, в данном случае, они могут сильно различаться, в отличие от культуры, берущей начало от единичной клетки. При исследовании микрофлоры ротовой полости были обнаружены микроорганизмы, относительно которых было сделано предположение, что они относятся к ранее не описанной филе. Их удалось отделить и секвенировать несколько отдельных геномов, создав некую совокупность данных – метагеном данной филы, объединивший данные по трём единичным клеткам, новый микроорганизм оказался нуждающимся в богатой среде, и, возможно, патогенным, что не противоречит действительности, поскольку, хотя его находили у здоровых людей, предполагалось его участие в развитии пародонтоза.
В отличие от методов отделения единичной клетки, способ накопления ДНК для исследования достаточно стандартный. Для этого используется полимераза phi29, которая  характеризуется высокой производительностью,  и праймеры случайной последовательности. Реакция, осуществляемая Phi29 эффективно протекает при постоянной температуре. С помощью полимеразы Phi29 из одной копии генома можно получить несколько микрограмм геномной ДНК, необходимой для анализа из единичной микробной клетки. В ходе реакции амплификации ДНК разветвляется, на только что синтезированные цепу уже могут садиться новые праймеры. В данной процедуре существуют два момента, которые, пока, не удаётся полностью преодолеть. Накопление происходит неравномерно, чтобы это предотвратить или, по крайней мере снизить такой эффект, реакцию предпочтительно проводить в минимальных объёмах. Другим недостатком методики является возникновение химерных перестроек, инсерций и делеций, в ходе её работы – примерно 1 случай на 20 тыс. пн. Единственным способом предотвратить возникновение данного артефакта является обработка нуклеазой S1, но этот метод ненадёжен. В остальном, последствия этого устраняются уже в ходе обработки данных.
Большая часть cеквенированных геномов единичной клетки неполны и сильно фрагментированы. Тем не менее, сама возможность открывает новые перспективы исследований – теперь можно полноценно исследовать микроорганизмы, которые невозможно накопить в культуре. Это и возможность более тонкого понимания роли тех или иных микроорганизмов в сообществе, и исследования корового (обязательного для каждого представителя вида) и общего (совокупность генов, выявляемых у данного вида) генома видов, и оценка неоднородности популяции, и ряд других перспектив.

Комментариев нет:

Отправить комментарий