Участки CRISPR и механизмы специфической защиты у бактерий

Бактерии могут приобретать передающуюся в дальнейшем по наследству устойчивость к инфекции бактериофагами, обусловленную встраиванием ДНК фага в геном бактерии. Существуют и другие пути защиты от фагов, например система рестрикции/модификации генома, уничтожающая неметилированную чужеродную ДНК, ингибирование адсорбции за счёт изменения структуры поверхностных рецепторов, ингибирование инъекции генетического материала или литической инфекции. Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) – геномные последовательности прокариот, обеспечивающие специфический иммунитет к определённому виду фагов, в них встраиваются чужеродные последовательности, которые помогают распознать фаг при повторном заражении и предотвратить развитие инфекции. CRISPR сохраняет информацию о прошлых встречах с фагами. Почти в половине изученных бактериальных геномов и 85% исследованных геномов архей обнаружены компоненты этой системы.

Повторы CRISPR включают 24-47 пн, разъединённых уникальными спейсерами чужеродного происхождения. Количество различных чужеродных участков в водном таком локусе составляет, в среднем 66, но может достигать нескольких сотен. Эти последовательности являются участками геномов фагов и защищают бактерию от воздействия фага имеющего в геноме сходную последовательность. Даже однонуклеотидная замена в геноме фага может привести к потере резистентности. CRISPR может защищать как от литической инфекции, так и от лизогенного состояния, но не ингибирует связывания фага и его инъекции. Количество участков CRISPR в геноме может быть различным. Например, геном Methanocaldococcus jannaschii содержит до 18 локусов.

Механизм защиты реализуется с использованием РНК. Их мишенью является ДНК фага. Процесс проходит в три этапа: встраивание нового участка в локус CRISPR, экспрессия и процессинг crRNA и интерференция. Кластеру повторов предшествует лидерная последовательность, AT-богатый регион, содержащий несколько сот пар оснований. Встраивание происходит так: повтор, следующий за лидерной последовательностью удваивается, и новый спейсер встраивается между двумя копиями. После встраивания спейсера в CRISPR происходит его транскрипция и процессинг с участием белков Cas, в результате чего образуются короткие интерферирующие РНК (crRNA). Транскрибируемая crRNA, содержит спейсер, фланкированный повторами. Распознавая специфические чужеродные матрицы, комплексы, включающие белки и crRNA осуществляют их разрушение, данные комплексы распознают последовательности ДНК. crRNA-опосредованное расщепление РНК, возможно, присутствует у P. furiosus но этот процесс не достаточно описан.

Интерференция происходит с участием белков Cas. Гены cas колокализованы с участками CRISPR. По структуре белки Cas подобны эндонуклеазам и ДНК/РНК-связывающим белкам. Было описано более 45 семейств белков Cas. Cas 1 и Cas 2 входят во все описанные системы CRISPR. В системы входят и белки других групп, например Cse и Csy. Белки Cas 1 и Cas2 осуществляют расщепление вирусного генома и встраивание специфических фрагментов в геном бактерии в 5′ области локуса CRISPR. Cas1 расщепляет двуцепочечную ДНК с образованием фрагментов ~80 пн. Cas2 S. solfataricus  расщепляет одноцепоччечную РНК по урацл-богатым участкам, однако подобных свойств не обнаружено у Cas2  Desulfovibrio vulgaris. Процесс встраивания и задействованные в нём белки ещё до конца не описан.

CRISPR/Cas – системы разделяют на типы I, II и III на основании филогении и наличия определённых белков Cas. Cas1 и Cas2 (Cas2 иногда образует слитную структуру с другими белками) входят во все варианты CRISPR/Cas систем. Cas3, Cas9 и Cas10 спецфичны для вариантов системы I, II и III соответственно. У некоторых микроорганизмов найдены системы CRISPR различных субтипов. Например, у T. thermophilus  обнаружено 12 локусов CRISPR, и 3 варианта оперона cas – тип I-E, тип III-A  и тип III-B. У микроорганизмов, имеющих системы CRISPR первого типа участки каждого повтора образуют структуру, включающую шпильку и петлю. Эта структура связывается с эндорибонуклеазой Cas6, происходит расщепление пре-crRNA и формирование зрелых crRNA, которые остаются связанными с эндорибонуклеазой. Эти молекулы служат основой сборки комплекса, в который также входят другие белковые молекулы. Комплекс распознаёт инородную ДНК, связывает и разрушает её. Механизм работы системы II-A Streptococcus pyogenes отличается от системы первого типа. В процессинге crRNA принимают участие короткие транскрипты транс-цепи – транс-активирующие РНК. Они комплементарны участкам повторов CRISPR в составе РНК-предшественника crRNA. В процессинге задействованы Cas9 (Csn1) и РНКаза RNase III. Cas9 в комплексе с транс-активирующей crRNA и crRNA связывает, распознаёт и разрушает целевую ДНК. Системы третьего типа, в общем, более сходны системами первого типа, но пре-crRNA не образует шпильку, Cas6 связывается с участком повтора, а для созревания crRNA, в этом случае, необходим не только Cas6, но и ещё несколько молекул, образующих комплекс.

Системы CRISPR/Cas регулируются на всех уровнях экспрессии – от транскрипции до посттрансляционных модификаций. Пока что какой-то общей картины из массива сведений об этом процессе сложить не удалось. Наиболее изучена регуляция систем первого типа E. coli и Salmonella enterica . Она осуществляется с участием белка H-NS – белка по функции сходного с гистонами эукариот, связывающегося с ДНК и регулирующего работу генома. Он располагается и в области CRISPR, при его отсутствии экспрессия активируется. Системы регуляции обеспечивают большую активность CRISPR/Cas при углеродном голодании, когда клетка более подвержена риску инфицирования бактериофагами. . LeuO – транскрипционный регулятор, активирующийся при аминокислотном голодании, активирующий транскрипцию оперона cas. Вероятно, фаговая инфекция в некоторых случаях ведёт к аминокислотному голоданию, с чем связан данный механизм, однако подтверждений этому пока нет. LRP – связывающийся с ДНК регуляторный белок, подавляющий экспрессию cas, который действует независимо от H-NS. У некоторых микроорганизмов он также принимает участие в регуляции cas. BaeR-S – регуляторная система, отвечающая на повреждения оболочки клетки. Когда абсорбированные на поверхности фаги воздействуют на оболочку, BaeS активируется, а BaeR связывается с ДНК и регулирует экспрессию генов, являясь антагонистом H-NS. В числе активируемых им генов находятся и гены  cas. У E. coli  Cas3 стабилизируется белком теплового шока HtpG и в его отсутствии система CRISPR/Cas теряет активность. У многих бактерий такого белка нет, но в работе системы оказываются задействованы другие белки теплового шока.

В некоторых случаях установлено, что система воздействует не только на бактериофагов. У  Streptococcus pneumoniae система CRISPR/Cas может препятствовать естественной трансформации. CRISPR в составе геномов S. aureus и S. epidermidis  препятствует конъюгации с плазмидой pG0400 и переносу информации межу этими двумя видами. Вероятно этот же механизм является естественным барьером, препятствующим распространению антибиотикорезистентности.