Адресная доставка лекарств с помощью аптамеров

Аптамеры – короткие олигонуклеотиды, связывающиеся со своими мишенями с высокой специфичностью за счёт вторичной и третичной структуры. Они специфичнее антител, их проще синтезировать и химически модифицировать, кроме того они лучше хранятся в лиофилизированном виде, нетоксичны, лучше проникают в ткани благодаря своему малому размеру. Такие молекулы могут быть компонентами терапевтических препаратов – как действующее вещество и как компонент, обеспечивающий адресную доставку. Лекарственные вещества, в состав которых входят аптамеры, могут применяться в терапии рака, инфекционных и воспалительных заболеваний, нарушений свёртываемости крови. Аптамеры могут быть специфичны и к белкам, и к коротким пептидам, и к вирусным капсидам, и сложным молекулярным комплексам. Они  могут обеспечивать селективную доставку интерферирующих РНК, токсинов, химиотерапевтических препаратов, радиоактивных молекул, липосом, вирусных капсидов, ферментов, наночастиц и других терапевтических агентов. Здесь мы остановимся на лекарственных препаратах, представляющих из себя молекулярные комплексы, в которых аптамеры обеспечивают доставку действующего вещества к клеткам.

 

Аптамеры – синтетические молекулы, для их получения не нужны живые клетки. Чтобы получить оптимальную последовательность для наработки, её отбирают из библиотек аптамеров против определённых мишеней. 10¹³ -10¹⁶ случайных последовательностей ДНК и РНК составляют библиотеку в процессе процедуры SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении). Библиотека состоит из олигонуклеотидов, в которых случайная последовательность 25–60 оснований фланкирована участками известной структуры. Эти известные участки нужны для амплификации библиотеки. Взаимодействующие с мишенью молекулы отбираются для амплификации и следующего раунда. SELEX может проводиться с помощью мембран, покрытых целевыми белками или целых клеток. В первом случае белки находятся на сорбенте: на гранулах, колонках, мембранах, чипах или на нитроцеллюлозных фильтрах. Отбор на клетках помогает не только получить воздействующие на них аптамеры, но и лучше понять молекулярные особенности раковых клеток. В клеточном варианте SELEX могут быть отобраны и аптамеры к неописанным лигандам, главное, что они специфичны к определённому типу клеток. Часто аптамеры модифицируют химически, включают запертые нуклеотиды LNA. Биоинформатически специфичность аптамера пока предсказать нельзя. После того, как найдена специфическая последовательность, необходим эмпирический контроль, показывающий отсутствие перекрёстных взаимодействий с другими антигенами.

Мишенями аптамеров для доставки препаратов против онкологических заболеваний могут быть маркеры кровеносных сосудов опухоли, такие как интегрин α_vβ₃, рецепторы VEGF, эндоглин, Tie-2, c-Met и другие. Нуклеолин, белок, участвующий в пролиферации, присутствующий в ядре всех клеток, но выходящий на поверхность только в опухолях тоже стал мишенью для разработки аптамеров, осуществляющих доставку лекарств в опухоль. Муцины на поверхности клетки могут поглощаться обратно, их содержание на поверхности опухолевых клеток велико. Терапевтические препараты, связавшиеся через аптамеры с муцинами также поступают внутрь клетки. По тому же принципу поступают в клетку препараты, связанные через аптамер с ассоциированным с онкогенезом рецептором EGFR, избыточно экспрессирующимися в ряде опухолей. Трансферин – лиганд, активирующий эндоцитоз. Аптамеры, модифицированные таким образом, что они не только распознают, но активируют этот рецептор, можно использовать для доставки в клетки молекул фермента при нарушении его работы. Гликопротеин оболочки ВИЧ gp120 оказывается на мембране инфицированных клеток и может быть мишенью аптамеров, связанных с противовирусными и-РНК. и-РНК входят в клетку и блокируют развитие инфекции.

Наночастицы, связанные с аптамерами могут применяться для доставки химиотерапевтических агентов и и-РНК, и, одновременно, для диагностики (путём визуализации контрастных наночастиц МРТ). Так можно осуществить адресное действие золотых наночастиц, ДНК-мицелл, ДНК-гидрогелей и углеродных нанотрубок, поскольку аптамеры достаточно просто модифицировать химически без утраты функциональности и конъюгировать с наноматериалами. Наночастицы и сами по себе могут использоваться как терапевтические агенты. Аптамеры в сочетании с Au-Ag наностержнями могут стать средством целевого фототермического разрушения, а полимерные наночастицы и липосомы – содержать в себе химиотерапевтический агент. Ещё один вариант применения наночастиц – фотохимические системы. Вещества, выделяющие синглетный кислород (цитотоксический агент)  под действием света могут, конъюгироваться с аптамерами, адресно доставляться в клетки и при освещении поражать их селективно. Дополнительно защитить нецелевые клетки можно введя в комплекс карбоновую нанотрубочку таким образом, чтобы она защищала фоточувствительную молекулу от разрушения, пока аптамер не связался с мишенью.

Гидрогели – сеть полимерных цепей, нерастворимых в воде. Они являются суперабсорбентами. Если включить в их состав аптамеры, то при взаимодействии с мишенями структура гидрогелей будет становиться более рыхлой. Так можно контролировать процесс выделения из гидрогеля лекарственных компонентов, поскольку процесс выделения будет запускаться только в присутствии определённых молекул-маркеров, являющихся мишенями аптамеров

Поскольку и-РНК и аптамеры имеют нуклеотидную природу, их просто связать друг с другом. иРНК могут сшиваться с аптамерами ковалентно, или, например, через стрептавидин-биотиновые структуры. Дисульфидный мостик, которым биотин пришивается к и-РНК разрушается в клетке и и-РНК освобождается. Так как на стрептавидине может связаться четыре молекулы биотина, конструкция может быть сложнее и включать в себя несколько разных аптамеров или и-РНК. Аптамеры можно непосредственно присоединять к и-РНК, причём более эффективной будет конструкция, где два аптомера пришито в и-РНК с обоих сторон, а и-РНК становится линкером между ними. Применение и-РНК, связанных с аптамерами менее опасно с точки зрения побочных эффектов, чем применение свободной и-РНК. Важно, чтоб при поступлении в клетку связанная с аптамером и-РНК не разрушалась в эндосоме, предполагается, что это могут обеспечить химические модификации аптамера.

Химиотерапевтические соединения могут связываться с аптамерами ковалентно, и, если связь чувствительна к кислотной среде, она будет разрушаться в клетке. Доцетаксел и доксорубуцин могут встраиваться в ГЦ богатые последовательности ДНК и РНК и без химических связей, за счёт физических взаимодействий. Можно также пришить его гидразоновым мостом. Можно создавать и более сложные комплексы, включающие различные химиотерапевтические агенты, наночастицы и аптамеры одновременно, при этом части аптамеров могут удерживать комплексы путём комплементарного взаимодействия.

Хотя первые лекарственные препараты на основе аптамеров уже применятся, и ещё больше - проходит клинические исследования, большая часть сложных биотехнологических решений пока что не покинула пределов лабораторий. Эффективность в эксперименте, в культуре клеток и при инъекции в опухоль у лабораторных животных – не показатель для оценки эффективности в клинике, поскольку требуются препараты, пригодные для системной терапии, при которой выше дозы и больше риск побочного эффекта. Тем не менее, следует ожидать постепенного вхождения в практику и более сложных комплексов, включающих аптамеры, поскольку эффективность их, зачастую, выше, чем эффективность тех же молекул по отдельности.