суббота, 4 октября 2014 г.

Биосенсоры на основе фагов - средство для выявление патогенов в пище.

Инфекционная доза патогенных бактерий, распространяющихся с пищей, мала и составляет порядка 10 клеток. Наиболее распространённые возбудители пищевых инфекций - Campylobacter, Salmonella, Listeria monocytogenes, Escherichia coli (E. coli) O157:H7, Staphylococcus aureus и  Bacillus cereus .При традиционном способе приготовления и употребления пищи такие патогенны погибают при тепловой обработке, но в современном мире риск заболевания растёт из-за большого количества готовых к употреблению продуктов в рационе человека. Ключевые вопросы, которые должны быть учтены при разработке методов для обнаружения пищевых патогенов, это дифференциации живых и мертвых клеток, автоматизация, простота и точность. Далеко не все лабораторные методы отвечают этим требованиям: культуральный метод требует нескольких суток культивирования, а молекулярные и иммунологические методы не всегда позволяют отличить погибшие микроорганизмы от активных. Одним из способов, отличающихся быстротой, специфичностью и способностью различать живые и мёртвые клетки являются разнообразные методики с использованием бактериофагов. Преимуществом бактериофагов является возможность работать в различных условиях, например в широком диапазоне pH, в присутствии нуклеаз и протеолитических ферментов. Как правило, бактериофаги очень специфично распознают клетки своего хозяина, хотя есть и исключения, когда один и ток же фаг может паразитировать в клетках бактерий различных видов. Полный инфекционный цикл фага протекает в течение часов. Всё это позволяет быстро провести оценку наличия патогена в сложных для исследования образцах продуктов питания, в том числе и вне лаборатории, с использованием биосенсоров. 

Даже встречающиеся в природе фаги дикого типа могут использоваться в составе биосенсоров. Например, фаг P22 применяется для выявления Salmonella , а фаг T4 - E. coli . Природные фаги можно связать на носителе путём химических модификаций. Однако такие фаги часто теряют свою специфичность после высушивания, их частицы  слишком крупные для использования в сенсорах некоторых типов, например основанных на оценке плазмонного резонанса, а вызываемая ими инфекция, сопровождающаяся лизисом клеток, ведёт к потере сигнала. Аналогичным образом потеря сигнала происходит из-за того, что некоторые фаги разрушают поверхностный рецептор, к которому они прикрепляются.
Ряд биоинженерных манипуляций позволяет адаптировать фаги к использованию в биосенсорах. Например, если встроить чужеродную генетическую последовательность в ген оболочки вируса, новый химерный продукт окажется на поверхности фагового вириона. Так можно модифицировать фаг лямбда, M13, f1, fd, T4 и T7, встраивая в оболочку, к примеру, биотин для прикрепления меток через стрептавидин вместо химической модификации капсида. К капсидам можно прикреплять флюоресцентные метки, например, квантовые точки и оценивать связывание фагов с бактериями путём проточной цитометрии или другими методами. Закрепление фага на носителе позволяет применять различные методики оценки присоединения к носителю бактерий за счёт их специфического взаимодействия с фагом. В качестве сенсоров могут использоваться пьезоэлектрические датчики, оптические волокна, и другие структуры, свойства которых изменяются при связывании на их поверхности небольших количеств бактерий.
Помимо целых фаговых частиц в биосенсорах могут применяться их компоненты. Белки связывающиеся с рецепторами, за счёт которых начинается взаимодействия фага и грамотрицательной бактерии-хозяина, не уступают антителам по способности к связыванию молекул, но более устойчивы к температуре, кислотности и протеазам. Они могут использоваться, например, в сенсорах на основе плазмонного резонанса, что предпочтительнее, чем целые фаговые частицы, поскольку отдельные белковые молекулы имеют значительно меньшие размеры. Грамположительные бактерии распознаются доменами белков-эндолизинов фага, связывающимися с клеточной стенкой. Они могут быть специфичными как к роду бактерий, так и к сероварианту – в зависимости от конкретного случая. Такие белковые домены, связанные на магнитных частицах могут использоваться для магнитной сепарации патогена. Белки, отвечающие за адгезию можно метить флюорохромами и использовать аналогично флюоресцентным антителам. Генетические модификации белков, связывающихся с клеточной стенкой, могут сделать их более чувствительными и специфичными.
Кварцевые резонаторы реагируют на изменения массы, исчисляющиеся нанограммами. Кварцевая пластинка, или пластинка другого пьезоэлектрика закрепляется между электродами и при подаче напряжения в ней возникают механические колебания. Связывание каких-либо частиц на поверхности такой пластинки будет снижать частоту колебаний, тем больше, чем большая масса оказалась связана на пластинке. На такой пластине можно разместить порядка 3 × 1010  фагов на см−2 и получить достаточно чувствительный сенсор, осуществляющий выявление патогена за несколько минут.
Поверхностные плазмоны – это волны переменной плотности электрического заряда, которые могут возникать и распространяться в электронной плазме металла вдоль его поверхности или вдоль тонкой металлической пленки, такие волны могут возбуждаться под воздействием поляризованного света. При определённых условиях  значительная часть энергии света превращается в энергию плазмонов, из-за чего интенсивность отраженного от поверхности металлической пленки света резко падает. Это явление и называют "поверхностным плазмонным резонансом". Если на носителе, в котором наблюдается это явление связать фаги или их молекулы, то при взаимодействии с бактериями можно наблюдать изменение характеристик плазмонного резонанса.
Оценка  электрохимического импеданса выявляет изменения на поверхности между электродом и раствором при и связывании на ней микроорганизмов  или изменении состава среды в результате их жизнедеятельности. Связывание бактерий ведёт к увеличению импеданса. Импеданс может замеряться дважды, поскольку он возрастает при прикреплении бактерий и падает при их лизисе – так можно быть уверенными в специфичности связывания. Биосенсоры импеданса могут работать с помощью фагов, закреплённых на электроде. Сенсоры электрического импеданса могут реагировать и на изменение электрохимических характеристик среды, например, когда при лизисе бактериальных клеток фагами освобождается большое количество ионов. В этом случае закрепление фага на электроде необязательно, процесс может протекать и в среде.
Для изменения состава среды может применяться также амперометрия, усилить сигнал можно добавляя в среду субстрат, который окисляют ферменты, освобождающиеся при гибели клетки. АТФ также хороший маркер лизиса леток, выявить его присутствие можно, например, добавив в среду люциферин и люциферазу и детектируя биолюминесценцию. Проблемой может быть высокое содержание АТФ в пищевых продуктах, поэтому в данном случае система, где фаг закреплён на электроде будет более чувствительной, так как повышение содержание АТФ будет происходить более выражено и более локально. Другим способом усиления сигнала является внесение в среду избытка АДФ, превращаемого в АТФ вышедшей из клеток при лизисе аденилат-киназой.
Репортерные фаги приводят к накоплению некого продукта в бактериальной клетке при инфекции, который можно выявить тем или иным методом и по такому сигналу судить о присутствии патогена. Накопление продукта отличает живые клетки – даже если фаг свяжется с погибшими клетками, накопления флюоресценции происходить не будет. Проблемы при использовании репортерных фагов - присутствие профагов, система рестрикции-модификации, и другие системы защиты, ведь в этом случае должно произойти не только связывание фага, но и развитие инфекции. Для этого репортерные гены вводятся в геном фага таким образом, чтобы при инфекции наблюдалась их экспрессия. Это могут быть люцифераза и расщепляемый ей люциферин, бета-галактозидаза, белки – центры нуклеации льда и флюоресцентные белки. Биолюминесценция – нехарактерный сигнал для пищевых образцов. Фаг A511, инфицирующий Listeria monocytogenes, с включённым геном luxAB  Vibrio harveyi , который экспрессируется вместе с поздними генами, позволяет в течение суток выявить патогена помощью люминесценции, что в 4 раза быстрее культурального метода. Сигнал люциферин-люциферазной системы дикого типа может затухать, но новые, полученные искусственно люциферазы дают стабильный сигнал.
Ген  lacZ кодирует β-галактозидазу, её активность, направленную на различные субстраты, можно выявить колориметрически, а также по возникновению люминесценции или флюоресценции. После накопления микроорганизма в культуре, детекцию можно производить уже через час после инокуляции фагом. Термостабильная β-гликозидаза CelB, кодируемая геном гипертермофильной археи Pyrococcus furiosus, тоже может использоваться для детекции с помощью хромогенного субстрата, в этом случае неспецифическую активность всех остальных ферментов можно подавить, нагрев образец. Ген inaW, найденный у псевдомонад, кодирует белок с центрами нуклеации льда. Если его встроить в фаг, он будет выводиться на наружную мембрану заражённых бактерий, например сальмонелл. С помощью специального красителя, реагирующего на изменение температуры кристаллизации, можно установить факт заражения. GFP – стабильный и нетоксичный репортер, не требующий субстрата. Он и родственные ему флюоресцентные белки могут использоваться для выявления патогенов в образце, в том числе и в мультиплексном режиме.

Как видно из всего вышесказанного, возможности использования фагов довольно широки. Их производство проще, чем, например, антител, поскольку накопление фагов происходит в бактериальных клетках. Кроме того, они более устойчивы, благодаря чему их можно использовать вне лаборатории и без сложных процедур по подготовке и очистке материала. Фаговые технологии для выявления патогенов в пище пока не вышли на рынок, но такой возможности в обозримом будущем исключать нельзя.

Комментариев нет:

Отправить комментарий