суббота, 26 июля 2014 г.

Создание хряща ex vivo

Суставной хрящ – мягкая ткань, содержащая органический матрикс, образованный волокнами коллагена (10 - 20% от общей массы) и протеогликанами (5 - 10% от общей массы). Клетки при этом составляют менее 10% объёма ткани. По мере удаления от поверхности хряща морфологические и биохимические особенности его клеток, хондроцитов, и матрикса меняются. У поверхности хрящ мягче, а его клетки имеют более овальную форму. В хряще взрослого человека нет сосудов и нервов, по своей природе эта ткань практически не способна к восстановлению в случае повреждения. Поэтому последние десятилетия разрабатываются различные имплантаты, которые можно пересадить при травме хряща или его повреждениях, связанных с остеохондрозом. Поликапролактоновый носитель, покрытый ростовыми факторами, можно имплантировать в место повреждения. Он будет заселён клетками в естественных условиях и поможет восстановить ткань, однако этого недостаточно для её полного заживления. При предварительном заселении клетками вне организма можно лучше контролировать свойства искусственного имплантата и создавать структуры более сходные со здоровым хрящом. 

Для создания биоинженерной ткани с целью последующей пересадки, в том числе, хряща, можно использовать собственные клетки пациента. Идеальный источник клеток должен быть доступен, а его клетки – легко накапливающимися в культуре и синтезирующими матрикс необходимого состава. Лучшая пролиферация клеток позволяет меньше травмировать пациента, отбирая клетки в меньшем количестве. Рост клеток хряща, полученных из взрослого организма медленный, и для накопления клеток требуется время. Культивирование хондроцитов в монослое приводит к их дедифференцировке. Кроме того, в трансплантации хряща чаще нуждаются пожилые люди, а их хондроциты растут медленно, и их метаболическая активность снижена. В клетки хряща могут дифференцироваться и стволовые клетки жировой ткани, хотя и менее эффективно, чем клетки костного мозга. Трансформирующие ростовые факторы бета (TGF-β), инсулин-подбный фактор роста 1 (IGF-1), костные морфогенетические белки, фактор роста фибробластов (FGFs) и фактор роста эпидермис (EGF) стимулируют формирования хряща из эмбриональных и мезенхимальных стволовых клеток. Механические качества имплантата в этом случае хуже, чем при использовании хондроцитов, в частности из-за изменений в составе внеклеточного матрикса.
В состав хряща входят различные коллагены в том числе II, VI, IX, X и XI, однако до 95% коллагена это коллаген II. В хряще волокна коллагена в поверхностном слое проходят по касательной к поверхности, тогда как в более глубоких слоях они ориентированы радиально. Такая структура делает хрящ устойчивым  растяжению. Аггреканы, специфические белки хряща, связываются с гиалуроновой кислотой, образуя протеогликановые агрегаты молекул с большой массой, заполняющие пространство между волокнами коллагеновой сети. Эти структуры, окружённые молекулами воды, обеспечивают устойчивость хряща к механическому воздействию. Сложная трёхмерная организация хряща формируется у животных, когда они начинают ходить, поэтому для её формирования ex vivo необходимо механическое воздействие.
Множество соединений рассматривает как материал для носителей, на которых можно вырастить искусственную хрящевую ткань. Если природные соединения обладают лучшей биосовместимостью, то состав синтетических соединений проще стандартизировать. Природные полимеры могут быть белковыми, такими как шёлк, фибрин и коллаген или углеводными, такими как хитозан, агароза, альгинаты и гиалуронан. Многие из них образуют гидрогели, благодаря чему их можно использовать для реконструкции богатых водой тканей, таких как хрящ. Возможны и решения, основанные на сочетании природных и синтетических материалов. Носитель для создания хряща должен быть биодергадируемым, но если он будет разрушаться слишком быстро хрящ получится непрочным, из-за недоразвития внеклеточного матрикса. Использование носителя, который может быть разрушен путём внешнего воздействия на определённом этапе культивирования – хорошее решение с точки зрения управления процессом создания имплантата. На качество имплантата влияет и жёсткость подложки. Слишком твердый и плотный носитель приведёт к тому, что выращенная на нём ткань будет хрупкой.
Носитель для будущей биоинженерной хрящевой ткани должен быть пористым. Оптимальный размер пор - 100 – 500 мкм. Для формирования пор в гидрогель включаются липидные пузырьки, заполненные газом. Однако обычный пористый носитель только формирует трёхмерное пространство роста клеток, но не воспроизводит структуру внеклеточного матрикса, характерную для хряща. Носители из наноразмерных волокон более схожи с внеклеточным матриксом. Кроме того их поверхность больше, что позволяет связать с ними больше биоактивных молекул. Для получения такой структуры используется несколько методов. Разделение фаз представляет собой метод для разделения раствора полимера на богатую полимером фазу и фазу растворителя, индуцированного термически или путем добавления осадителя полимера. Так формируется трёхмерная волокнистая сеть, волокна которой имеют толщину от 50 нм до  500 нм. Изменяя параметры обработки можно влиять на диаметр пор и толщину волокон. Так как для работы можно использовать форму, есть возможность получать имплантаты сложной конфигурации. В технологии электроспиннинга используется электрический заряд для вытягивания из жидкости очень тонких волокон (как правило, микро- и наноразмера), так тоже можно получить структуры, имитирующие внеклеточный матрикс.
Используя фактор роста фибробластов FGF, тромбоцитарный фактор роста PDGF и трансформирующий ростовой фактор можно ускорить рост клеток и повысить механические качества имплантата. Нужно учитывать, что ростовые факторы нестойки. Время их жизни исчисляется минутами. Во многом эффект ростового фактора зависит от режима дозирования, например, TGF-β3 более эффективно стимулирует формирования хряща, если он эпизодически поступает в малых дозах. Иногда сочетание ростовых факторов может дать кумулятивный эффект, более выраженный, чем эти факторы по отдельности. Но и, наоборот, эффективные порознь факторы могут не оказать стимулирующего действия в сочетании.
Незрелый хрящ содержит кровеносные сосуды, приносящие вглубь ткани питательные вещества и выносящие продукты жизнедеятельности клеток. Решить проблему поступления питательных веществ в ткань можно, например, с помощью каналов вглубь носителя. Несколько таких тонких каналов на квадратный сантиметр не снизят механических качеств структуры. Динамическая нагрузка позволяет жидкости, содержащей питательные вещества активно проникать в матрикс. Статическая нагрузка снижает поглощение искусственным хрящом питательных веществ. Гидростатическое давление запускает дифференцировку стволовых клеток в клетки хряща и способствует получению имплантата лучшего качества.

Факторы, влияющие на то, каким будет искусственный хрящ – источник клеток для его построения, носитель для клеток, ростовые факторы и механическая нагрузка. При создании искусственного хряща важно не только заставить клетки синтезировать коллаген в большом количестве, но и обеспечить продукцию различных типов матрикса на различной глубине, причём в соответствии со своеобразной трёхмерной структурой, как это происходит в организме. Изменение размера пор в глубине носителя, создание носителей из различных пластов, заселение носителя разными субпопуляциями клеток на различной глубине – всё это может помочь приблизить структуру искусственного хряща к реальной. Сложные комбинированные носители из различных материалов позволили стимулировать дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в клетки хряща, характерные для различной глубины. Неоднородность механической нагрузки в зависимости от глубины также может помочь воссоздать сложную структуру хряща. Потребность в своевременной подаче реагентов и разнообразных нагрузках требуют специального оборудования для строгого контроля процесса. 

Комментариев нет:

Отправить комментарий