воскресенье, 4 мая 2014 г.

Аптасенсоры: как это работает?

Биосенсоры – компактные устройства для распознавания тех или иных молекул. Они состоят из биологической составляющей, например, аптамеров или антител, и компонента, генерирующего сигнал. Аптамеры – небольшие молекулы РНК или ДНК, специфически связывающиеся с мишенями различной природы. В отличие от антител, аптамеры к мишени можно подобрать, даже если она является токсичной или просто неиммуногенной, поскольку они получаются и накапливаются синтетическим путём (в ПЦР). Работающий на основе аптамеров биосенсор называют аптасенсором. Благодаря своей химической структуре аптамеры устойчивы к различным воздействиям, что облегчает их хранение и использование, их способность связываться с мишенью не снижается при химической модификации, которая может потребоваться, например, для закрепления аптамера на носителе. В чувствительности аптамеры не уступают антителам. Некоторые аптасенсоры можно использовать многократно – аптамеры связываются с мишенями обратимо.

Аптасенсоры работают на самых различных принципах детекции, в зависимости от особенностей мишени, требований к их чувствительности  и условиям их использования. Здесь мы рассмотрим некоторые из способов работы с аптасенсорами, то есть способы оценить связывание аптамера с мишенью. В простейшем случае аптамер непосредственно связывается с мишенью и претерпевает конформационные изменения. В результате меняется: размер или вес молекулярного комплекса, куда входит аптамер, способность аптамера связываться с различными молекулами или наночастицами. В других случаях используются разнообразные метки и способы усиления сигнала. В зависимости от технологии, сигнал возникает в ответ на наличие или отсутствие аналита в среде. Аптасенсор, отвечающий на отсутствие мишени будет менее чувствителен, но он лучше подходит для случаев, когда взаимодействие аптамера и мишени характеризуется низкой афинностью.
В электрохимических биосенсорах аптамеры наносятся на электрод. Связанные на носителе аптамеры имеют подвижную гибкую структуру, но принимают более устойчивую конформацию при связывании с мишенью. Изменение положения заряженной молекулы, которая присоединена к аптамеру, относительно электрода, происходящее в этот момент, выявляется по изменению потенциала на электроде. Чтобы сделать такой метод точнее можно полностью блокировать взаимодействие метки и электрода, например, добавить в молекулярный комплекс ДНК, комплементарную аптамеру, благодаря чему аптамер перестанет быть гибким, и, пока он не свяжет мишень, заряженная метка будет держаться на постоянном расстоянии от электрода. Другой вариант конструирования биосенсора на каком либо носителе, например на поверхности электрода не требует меток и мало зависит от конформации аптамера. На носителе закрепляются цепи ДНК, комплементарные аптамера, и на них связывается аптамер. В присутствии мишени аптамер покидает молекулярный комплекс и физические характеристики поверхности изменяются, что ведёт к изменению сигнала. Похожую методику можно применить не только в электрохимическом аптасенсоре: в аптамер могут быть включены флуоресцентные метки для визуализации его отсоединения от носителя.
Одноцепочечная ДНК, в отличие от двуцепочечной препятствует агрегации золотых наночастиц в солевом растворе. Можно разместить на наночастицах аптамер, связанный с комплементарной цепью, тогда в солевом растворе будет наблюдаться их аггрегация. В таком случае связывание аптамера с мишенью делает наночастицы устойчивыми к агрегации. Изменение цвета раствора при этом можно увидеть невооружённым глазом, хотя точно оценить изменения можно с помощью более точных приборов – колориметров. Аптамеры могут обладать энзиматической активностью, в частности, пероксидазной, и, в несвязанном состоянии катализировать реакции, в частности, с образованием цветного продукта. Таким образом можно оценить присутствие мишени аптомера в материале по интенсивности накопления окрашенного продукта, то есть также колориметрически.
Флуоресцентные метки в аптасенсорах могут действовать по-разному. Флюорофор, например, может быть связан с аптамерами, закреплёнными на золотых наночастицах. В таком состоянии он не флуоресцирует. Если в среде есть мишень аптамера, она вытеснит флюорохром их комплекса и можно будет обнаружить флуоресцентный сигнал. Существует и такой вариант флуоресцнтной детекции, когда аптамер связывается с ДНК-зондом и флуоресцентным соединением, которое может флуоресцировать только в присутствии двуцепоченой ДНК, ДНК-зонд, позволяющий структуре существовать в виде двуцепочечной ДНК, вытесняется нефлуоресцирующим аналитом из исследуемого образца, по затуханию флуоресценции можно оценить содержание аналита. Аптамеры, соединённые с флюорохромом и гасителем, наподобие зонда beacon включают шпильки, сближающие гаситель и светящуюся молекулу, которые размыкаются при связывании с мишенью. Размыкание шпильки приводит к устранению ингибирования флуорисцентного сигнала. Аптамер также можно связать с флюорохромом и гасителем, но только чтобы они взаимодействовали при связывании аптамера с мишенью, тогда флуоресценция будет свидетельствовать об отсутствии мишеней в изучаемом материале.
Приложение переменного тока вызывает в кристалле кварца колебания. За счёт этого явления работают микрогравиметрические аптосенсоры, поскольку частота колебания в кристаллах изменяется при изменении массы молекул, связанных на его поверхности. При связывании аптамеров с мишенями масса изменяется, и такое изменение может быть зарегистрировано. Достаточно широко используются аптосенсоры без меток, на основе детекции поверхностного плазмонного резонанса. В таких сенсорах на стекло наносится металлическая (обычно золотая или серебряная плёнка), и на ней располагается стеклянная призма. Электроны на поверхности золотых частиц коллективно осциллируют в ответ на облучение светом с определённой длиной волны. При этом в спектре отражённого света появляются пики, которых не было в спектре возбуждающего света. Если на поверхности иммобилизованы молекулы, которые могут поглощать свет, и его частота поглощения перекрывается с частотой плазмонного резонанса, то в пике рассеяния появляется провал в той области спектра, где это происходит. Таким образом, используя аптомеры и оборудование для оценки поверхностного плазмонного резонанса можно узнать, связались или нет аналиты-мишени с соответствующими аптамерами. На носителе можно разместить аптамеры различной специфичности для единовременной оценки различных аналитов. Микроструктурирование носителей увеличивает выраженность изменений поверхностного плазмонного резонанса и повышает точность метода.
Другой физический метод реализован в волноводных аптасенсорах. Константа распространения света через волновод изменяется при абсорбции молекул на его поверхности волновода. Цветовая метка аналита повышает чувствительность волноводного аптасенсора. Чувствительность волноводных сенсоров в 4 раза превышает чувствительность аптасенсоров с детекцией поверхностного плазмонного резонанса. Использование перворированного носителя увеличивает чувствительность ещё в 5-10 раз. Повышается чувствительность метода и при использовании флуоресцентных красителей.
Возможно использование в аптасенсоре и усиления сигнала, как это делается при иммунофлуоресцентном анализе: к захваченной аптамером мишени присоединяются меченные вторичные аптамеры или антитела. Есть и другой способ усиления сигнала. Аптамер конструируется так, чтобы в его состав входил одноцепочечный участок и участок, формирующий шпильку. При связывании с лигандом такая шпилька раскроется, после чего на неё может сесть праймер, с помощью которого можно накопить фрагмент путём ПЦР. После накопления двуцепочечного продукта его можно выявить с помощью красителя, светящегося при взаимодействии с двуцепочечной ДНК.

Разнообразие методов детекции позволяет конструировать различные аптасенсоры, приспосабливая их под разнообразные задачи медицины, промышленности, судебной экспертизы. Они дают возможность быстро проводить исследование, в ряде случаев, оборудование для него можно выполнить в компактном варианте и использовать вне лаборатории. Однако, в настоящее время это направление только развивается и широкого внедрения в практику аптасенсоры пока не получили.

Комментариев нет:

Отправить комментарий